缓冲液怎么挑选
用Tris-HCl仍是PB,挑选的依据是蛋白质的稳定性和生机在哪个缓冲液中好,浓度一般50mM,但是缓冲液应与样品缓冲液有相同的pH和离子强度。
洗脱选用的离子强度的巨细范围应该怎么确认
离子柱交流纯化是使用离子交流剂上的可解离基团(活性基团)对各种离子的亲和力不一样到达别离目的的一种别离技能,离子强度越大,洗脱越好。详细的离子浓度范围能够很大,0.01mol/l到1mol/l,乃至3.0mol/l,PH值的范围液很广。首要根据你的蛋白质的等电点。
蛋白挂在阳离子交流柱上洗脱不下来
1. 蛋白与离子柱得结合太强,换弱阳的琼脂糖凝胶介质,比如由sp的换成CM。
2. 减少离子柱与样品的结合时间,避免蛋白沉在柱上。
3. 若洗不下来的是杂蛋白直接用0.1M氢氧化钠洗。
标签蛋白易洗脱
1. 离子交流每个梯度都洗下来方针蛋白,大或许性是上样量过大,流速太大,主张添加清洗的体积数,减少上样量,降低上样速度
2. 上样完洗脱前,清洗的不完全。
3. 标签没有表达出来:
(1)或许是因为折叠构象不正确导致标签在重折叠时没有位于蛋白质分子的外表上无法与离子柱结合。
(2)标签在折叠时没有位于蛋白质分子的外表上。
4. 填料有问题,换填料。
5. PH、离子强度是否合适,平衡缓冲液是否应与样品缓冲液pH、离子强度相同。
标签包涵体蛋白易洗脱
1. 蛋白质的折叠形状发生了改变躲藏了标签,而使得蛋白质无法挂柱。
(1)因临近的空间的一个或多个氨基酸的空间位阻阻止了标签与离子柱形成共价键。
(2)环境影响:pH,离子强度,其他蛋白质分子,缓冲溶液类型,有关影响蛋白质分子外表的试剂等。添加所提的蛋白质样品的溶解度或还能够加大离子型、非离子型或两性离子外表活性剂的浓度或类型